異基因CAR-T細胞治療的發(fā)展現狀

目前，使用嵌合抗原受體（CAR）T細胞進行治療已成為治療某些血液系統(tǒng)腫瘤患者的有力工具。然而，所有FDA批準的CAR-T細胞療法均基于從患者身上分離的自體T細胞，盡管有顯著的臨床效果，該策略仍有幾個重要的局限性，即治療成本非常高，個別生產過程可能存在問題。

與使用自體CAR-T細胞的治療相比，由同種異體供體材料產生的CAR-T細胞具有三個主要優(yōu)勢。首先，根據個體患者的既定治療方案，可以提前生產同種異體CAR-T細胞，并毫不延遲地交付。其次，異基因供體來源的T細胞不會暴露于多輪抗白血病治療中，因此它們更容易接受體外操作。第三，一小部分患者最終可能永遠無法獲得質量良好、數量有治療意義的自體CAR-T細胞產品。

目前，已有多項異基因CAR-T細胞療法進入臨床階段，其中一些臨床試驗展現出良好的應用前景，可能為更多更廣泛的患者帶來福音。

同種異體CAR-T細胞可以并且應該代替自體CAR-T細胞或與自體CAR-T細胞結合使用時，有幾種情況：i）有阻礙自體產品制造的物流問題；ii）制造失敗，其中同種異體產品可以替代自體產品，而不會延遲計劃的輸注；iii）當自體產品在患者體內無法擴增時，輸注同種異體CAR-T細胞產品；iv）由于患者的T細胞數量較低和/或疾病進展迅速，無法預先制造自體CAR-T細胞產品；v） 異基因CAR-T細胞產品通過設計成為造血干細胞移植的橋梁。

盡管使用同種異體CAR-T細胞進行治療有許多優(yōu)點，但這種技術有兩個主要缺點。首先，受者的細胞對所給予CAR-T細胞的天然T細胞受體（TCR）可能誘導其激活并導致急性移植物抗宿主病（GvHD）。其次，CAR-T細胞對宿主免疫系統(tǒng)是外來的，這可能會導致它們迅速從循環(huán)中清除。

因此，異基因CAR-T細胞的制造主要是通過各種手段破壞CAR-T細胞的TCR和MHC-1分子。破壞TCR可以通過三種不同的方式進行：抑制蛋白的表達；通過使用TALENS或CRISPR/Cas9敲除編碼TCR鏈的基因；通過shRNA介導mRNA的沉默。

上面的方法均不能從細胞群中100%的去除TCR。因此，剩余TCR+細胞的額外消耗是制造同種異體CAR-T細胞的一個重要部分，這在很大程度上決定了GvHD的發(fā)生和治療效果。消除TCR +細胞的方法是基于CliniMACS™的裝置。簡言之，在引入CAR和TCR消除后，首先用生物素化的抗TCR抗體孵育T細胞，然后用與磁性微球結合的抗生物素抗體孵育T細胞。隨后，殘留的TCR+細胞被CliniMACS清除。

此外，為了增加異基因CAR-T細胞的持久性，可以考慮通過基因敲除免疫排斥的關鍵介質MHC-I分子，這可以通過破壞編碼β-微球蛋白的基因來實現。

根據臨床經驗，同種異體CAR-T細胞清除腫瘤細胞的能力取決于初始擴增、持續(xù)時間、GvHD的發(fā)生以及宿主免疫系統(tǒng)排斥這些細胞的能力。在制定管理異基因CAR-T細胞的策略時，可以選擇不同來源的細胞及細胞亞群。

αβT細胞

用于制造同種異體CAR-T細胞的T細胞主要來源于外周血單個核細胞，尤其是具有由α和β鏈組成的TCR的細胞，其構成健康供體循環(huán)T細胞的約90%。由于αβT細胞在外周血中的相對豐度和快速增殖的能力，它是制造同種異體CAR-T細胞的一個有吸引力的靶點。然而，該細胞亞群在急性和慢性GvHD的發(fā)病機制中起主要作用。因此，需要通過基因編輯手段破壞TCR，以減少發(fā)生GvHD的風險。

病毒特異性T細胞

除了基因編輯方法外，減輕GvHD的策略之一是使用基于病毒特異性T細胞的CAR-T細胞，這些細胞結合了CAR的抗腫瘤活性和降低GvHD風險。GvHD風險與TCR多樣性相對應，因此，輸注病毒特異性記憶T細胞后GvHD減少可能是由于病毒特異性記憶T細胞中TCR的功能受到限制。此外，這種策略的一個可能的不足是初始病毒特異性記憶T細胞的數量較低。

γδT細胞

供體來源的γδT細胞通過利用其固有受體以不依賴于MHC分子的方式識別多種腫瘤抗原，并且可以在沒有TCR清除的同種異體環(huán)境中應用。此外，一旦激活，它們可以通過促進其他免疫細胞的功能，進而產生進一步的適應性免疫反應。

誘導多能干細胞（iPSC）

誘導多能干細胞應用于CAR-T具有顯著的優(yōu)勢：iPSC具有自我更新能力，能夠在體外長期培養(yǎng)，可以在體外進行各種復雜和精確的基因改造；iPSC具有分化為人體所有細胞類型的能力，可產生大量的功能性T細胞。盡管存在一些限制，但IPSC仍具有均勻和大規(guī)模生產的CAR-T細胞的潛力。

NK細胞

異基因NK細胞對于過繼性細胞治療（ACT）是相當安全的，因為它們通常不介導發(fā)生GVHD。此外，NK細胞僅分泌少量IFN-γ和GM-CSF，不產生啟動CRS的IL-1和IL-6。其次，除了通過單鏈抗體識別腫瘤表面抗原來抑制癌細胞外，NK細胞還可以通過多種受體識別各種配體來抑制癌細胞，例如自然細胞毒性受體（NKp46、NKp44和NKp30）、NKG2D和DNAM-1（CD226）。最后，NK細胞在臨床樣本中非常豐富，可以從外周血（PB）、臍帶血（UCB）、人類胚胎干細胞（HESC）、iPSC甚至NK-92細胞系中產生。

ALLO-715抗BCMACAR-T細胞（NCT04093596）

這是一項1期臨床試驗，招募患有r/r多發(fā)性骨髓瘤患者。截至2020年10月，共有31名患者納入安全人群。療效人群包括26名患者，分為四個劑量水平的細胞（40、160、320和480×10⁶），平均隨訪時間為3.2個月。

ALLO-715的CAR-T細胞受體包括具有4-1BB共刺激結構域的單鏈可變抗BCMA片段。為了防止移植物排斥反應，并在不影響ALLO-715 CAR-T細胞的情況下允許選擇性淋巴細胞耗竭，引入了CD52和TRAC的KOs。

26名患者的所有劑量組和淋巴清除方案的總有效率（ORR）為42%（11/26）。在接受320×106細胞ALLO-715治療的10名患者中觀察到了*的抗癌活性。對于該隊列，ORR為60%（6/10），其中4名患者（40%）觀察到非常好的部分響應。

在45%（14/31）患者中報告了CRS。一名患者在ALLO-715輸注后一天出現非中性粒細胞減少性發(fā)熱和多灶性肺炎，一次5級發(fā)作導致呼吸衰竭和死亡。研究認為這一事件與進行性骨髓瘤以及環(huán)磷酰胺和ALLO-647預處理方案有關。研究報告，42%（13/31）患者在治療期間出現了感染性疾病，其中13%的患者出現了3級感染。未觀察到GvHD或ICAN病例。

ALLO-501抗CD19CAR-T細胞（NCT03939026）

ALLO-501是一項針對復發(fā)/難治性非霍奇金淋巴瘤（r/r NHL）患者的I期臨床試驗，ALLO-501CAR-T基于小鼠CD19特異性單鏈抗體（4G7）。截至2021年4月19日，41例患者接受了ALLO-501治療，有效人群包括32例患者，共三個劑量組（40, 120和360×10⁶）。治療包括先前的淋巴清除，包括使用氟達拉濱加環(huán)磷酰胺和ALLO-647。

結果顯示，整體ORR為75%（24/32），50%（16/32）*緩解（CR）。研究報告11例（27%）患者出現輕度至中度CRS，1例（2%）出現3級神經毒性，登記患者中無GvHD。感染率為61%（25/41），與使用自體CAR-T細胞的試驗中觀察到的感染率相似。

UCART19抗CD19CAR-T細胞

UCART19是一種基于慢病毒轉導CAR19并使用TRAC/CD52特異性TALENs的CAR-T細胞產品。TALENs用于在編碼TCR和CD52α恒定鏈的基因中引入KOs，以最小化GvHD風險。用磁珠去除殘留的TCR+細胞后，只有0.7%的細胞具有可檢測的細胞表面TCR。

在7名兒童的PALL試驗和14名成人的CALM試驗中，評估了UCART19的安全性和有效性?；颊弑仨氂蠧D19+B細胞急性淋巴細胞白血病的證據，在UCART19輸注前，所有患者均進行了淋巴清除：17名患者（81%）給予了氟達拉濱、環(huán)磷酰胺和alemtuzumab，4名患者（19%）給予了氟達拉濱和環(huán)磷酰胺。

PALL試驗中的兒童接受UCART19（1.1–2.3×10⁶/kg），CALM試驗包括劑量遞增階段（6×10⁶細胞、6–8×10⁷細胞或1.8–2.4×10⁸細胞）。全體患者和接受含alemtuzumab的淋巴清除患者的ORR分別為67%（14/21）和82%（14/17）。14名患者中有10名（71%）獲得*緩解，并繼續(xù)進行異基因造血干細胞移植（HSCT）。研究報告，在2019年8月的數據截止日期，14名獲得響應的患者中有10名（71%）隨后復發(fā)或死亡。6個月時無進展生存率為27%。

UCART19觀察到的副作用似乎與報道的自體抗D19 CAR-T細胞的副作用相似。CRS是UCART19治療最常見的不良事件（91%的患者），等級≥3的CRS出現在三名患者中。只有兩名患者（10%）在UCART19輸注后出現1級GvHD。

CTX110抗CD19CAR-T細胞（NCT04035434）

UCART19和其他CAR-T細胞使用隨機整合的病毒將編碼CAR結構的基因傳遞給T細胞DNA。CRISPR Therapeutics使用CRISPR/Cas9將CAR結構精確插入TRAC位點。CTX110是使用該技術靶向CD19+B細胞惡性腫瘤的CAR-T細胞。

目前，正在進行的1期CARBON臨床試驗評估了CTX110在11例患有r/r NHL患者中的安全性和有效性。11名患者在使用氟達拉濱和環(huán)磷酰胺進行淋巴細胞清除后，以四種劑量水平（30、100、300或600×10⁶）輸注CTX110細胞。

結果顯示，在30–300×10⁶ 劑量組中，沒報告有GvHD病例。其它不良反應包括3例等級≤2的CRS（30%）和1例2級ICAN（10%）。36%（4/11）的患者獲得CR。

PBCAR0191抗CD19CAR-T細胞（NCT03666000）

Precision BioSciences公司的同種異體產品PBCAR0191使用了基于I-CreI歸巢內切酶的通用基因組編輯平臺ARCUS，將CD19特異性CAR插入TRAC位點。I期臨床研究的初步數據顯示， 27例患者（16例為r/r NHL，11例為r/r B-ALL）中，所有劑量組的ORR和CR分別為55%（15/27）和37%（10/27）。

最近，另一項研究報告了PBCAR0191高劑量（3×10⁶個細胞）并伴有增強淋巴清除（氟達拉濱加環(huán)磷酰胺）的患者隊列的臨床結果。試驗共納入21例患者，包括16例非霍奇金淋巴瘤患者和5例B-ALL患者，對其中13例NHL患者和5例ALL患者的治療效果進行了評估。結果顯示，ORR為83%（15/18），CR為66%（12/18）。大多數不良事件是輕微的，在1例NHL患者中觀察到ICANS 3級，在31%（5/16）NHL患者中觀察到3級感染，在80%（4/5）B-ALL患者中觀察到3級感染，未觀察到GvHD的證據。

CYAD-101（NCT03692429）

CYAD-101是由Celyad Oncology開發(fā)的一款基于NKG2D受體和TCR抑制分子（TIM）的非基因編輯同種異體CAR-T細胞。NKG2D受體可以識別表達在大多數實體瘤和血癌細胞表面的8種不同的配體，使其可以同時靶向多種不同的癌癥；TIM旨在消除負責GvHD的免疫反應，從而避免GvHD。

CYAD-101在不可切除轉移性結直腸癌患者的alloSHRINK I期研究中進行了評估。在標準預處理化療（FOLFOX）后，15名患者接受三種劑量水平中的一種（每次輸注1×10⁸、3×10⁸或1×10⁹細胞）。研究沒有報告劑量限制性毒性或GvHD。在15名患者中，2名（13%）患者獲得部分緩解（PR），9名（60%）患者病情穩(wěn)定（SD）。

CIK抗CD19細胞（NCT03389035）

有研究提出了一種基于“睡美人"轉座子系統(tǒng)的異基因CAR-T細胞，用CARs產生CIK細胞。根據CIK細胞方案，刺激細胞分化為記憶T細胞亞群。在多中心臨床研究中（NCT03389035），對13例HSCT后復發(fā)的B-ALL患者使用CARCIK-CD19細胞。研究沒有報告ICANS或GvHD病例，嚴重不良事件是接受最高劑量治療患者出現的兩例1級和2級CRS。61.5%的患者出現*緩解，而在接受兩種最高劑量的6名患者中，85.7%的患者出現*緩解。

ATA188（NCT03283826）

ATA188是一款由Atara公司開發(fā)的異基因EBV特異性T細胞免疫療法。在針對多發(fā)性硬化癥的的I期試驗中評估了ATA188這種EBV特異性T細胞亞群的初步療效和安全性。結果顯示，在輸注ATA188細胞后無GvHD或CRS的記錄，進行性多發(fā)性硬化癥患者對ATA188耐受性良好，未見劑量限制性毒性。

Vγ9Vδ2 T細胞

異基因Vγ9Vδ2 T細胞治療在晚期惡性肝癌（NCT03183232）、肺癌（NCT03183219）、胰腺癌（NCT03183206）或乳腺癌（NCT03180437）中進行了臨床評估。輸注異基因Vγ9Vδ2 T細胞后未報告重大不良事件（CRS、GvHD）。

NK細胞

關于工程化異基因CAR-NK細胞，有研究報告了一期和二期試驗的結果，其中11名r/r NHL或CLL患者接受了來自臍血的HLA不匹配的抗CD19 CAR-NK細胞治療。研究沒有報告CRS、ICAN和GvHD，所有患者都有可逆的血液毒性事件，主要與淋巴細胞清除有關。在平均13.8個月的隨訪中，7名患者（64%）*緩解。

在完成的針對AML患者靶向CD33的CAR-NK-92試驗中，在輸注CD33-CAR NK-92細胞后僅有兩例I級CRS，無GvHD病例。然而，不幸的是，兩名患者復發(fā)，一名患者對治療無反應。

顯然，使用來自健康捐贈者的CAR-T細胞產品是有利的，因為它對患者的免疫狀態(tài)依賴性較小，更標準化，并且由于生產成本較低，大大擴大了患者獲得治療的機會。此外，還必須考慮到，在疾病迅速發(fā)展時，自體CAR-T細胞制造所需的時間是一個關鍵因素；另外，一小部分患者可能永遠無法獲得數量、質量良好的自體CAR-T細胞。

然而，異基因CAR-T細胞可能導致GvHD，并且自身可能被受體的免疫系統(tǒng)排斥。此外，與自體CAR-T細胞相比，同種異體CAR-T細胞的療效和應答率較低，這在很大程度上歸因于其較低的持久性。但從長遠來看，這也可能是一種安全優(yōu)勢。

目前，多項研究正在臨床中檢驗不同靶點和不同技術平臺開發(fā)的異基因CAR-T細胞療法，隨著現有技術的進一步成熟和新技術的開發(fā)，相信異基因CAR-T細胞療法終將會使更多的腫瘤患者受益。

參考文獻：

1.Strategies to Circumvent the Side-Effects of Immunotherapy Using Allogeneic CAR-T Cells and Boost Its Efficacy: Resultsof Recent Clinical Trials. Front Immunol. 2021; 12: 780145.