mRNA疫苗：癌癥免疫治療新時(shí)代的曙光

腫瘤免疫治療旨在激活宿主的抗腫瘤免疫，形成腫瘤抑制微環(huán)境，最終實(shí)現(xiàn)消除腫瘤，提高患者的整體生存率。腫瘤疫苗是一種很有前途的抗腫瘤免疫治療手段。針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原（TAAs）或腫瘤特異性抗原（TSAs）的疫苗可以特異性攻擊和摧毀這些抗原高水平表達(dá)的惡性腫瘤細(xì)胞，并通過(guò)免疫記憶實(shí)現(xiàn)持續(xù)的腫瘤殺傷。因此，與其他類型的免疫治療相比，癌癥疫苗理論上可以提供特異、安全和耐受性良好的治療效果。

基于mRNA的核酸疫苗是在30多年前提出的，mRNA疫苗比傳統(tǒng)疫苗有許多優(yōu)點(diǎn)：與某些病毒疫苗不同，mRNA不會(huì)整合到基因組中，從而避免了對(duì)插入突變的擔(dān)憂；mRNA疫苗可以以無(wú)細(xì)胞的方式制造，從而實(shí)現(xiàn)快速、經(jīng)濟(jì)、高效的生產(chǎn)。此外，單個(gè)mRNA疫苗可以編碼多種抗原，增強(qiáng)針對(duì)適應(yīng)性病原體的免疫反應(yīng)，并能夠以單一配方針對(duì)多種微生物或病毒變體。

mRNA疫苗是一類重要的癌癥疫苗，能夠編碼和表達(dá)TAA、TSA及其相關(guān)細(xì)胞因子。mRNA癌癥疫苗可以刺激體液免疫和細(xì)胞免疫，提高這些疫苗對(duì)不同疾病和患者的適應(yīng)性。目前，多種mRNA癌癥疫苗正在臨床中進(jìn)行開發(fā)，為癌癥免疫治療帶來(lái)新的曙光。

體外轉(zhuǎn)錄（IVT）mRNA模擬內(nèi)源性mRNA的結(jié)構(gòu)，有五個(gè)部分，從5?到3?包括：5?cap，5?非翻譯區(qū)（UTR），一個(gè)編碼抗原的開放閱讀框，3?UTR和一個(gè)PolyA尾。

與天然真核mRNAs一樣，5′端帽結(jié)構(gòu)包含一個(gè)7-甲基鳥苷核苷，5′端結(jié)構(gòu)會(huì)在空間上保護(hù)mRNA不被核酸外切酶降解，并與翻譯起始因子蛋白協(xié)同工作，招募核糖體以啟動(dòng)翻譯。PolyA尾的長(zhǎng)度間接調(diào)節(jié)mRNA翻譯和半衰期。

編碼區(qū)兩側(cè)的5′和3′UTR調(diào)節(jié)mRNA翻譯、半衰期和亞細(xì)胞定位，來(lái)自高表達(dá)基因（如α-和β-珠蛋白基因）的天然UTR是合成mRNAs的選擇。此外，UTR可根據(jù)細(xì)胞類型進(jìn)行優(yōu)化，如通過(guò)去除3′UTR中的miRNA結(jié)合位點(diǎn)和富含AU的區(qū)域，將mRNA降解降至。

mRNA疫苗的開放閱讀框是最關(guān)鍵的組成部分，盡管開放閱讀框不像非編碼區(qū)那樣具有可塑性，但可以通過(guò)優(yōu)化密碼子，從而在不改變蛋白質(zhì)序列的情況下增加翻譯。例如，CureVac AG公司發(fā)現(xiàn)人類mRNA密碼子很少在第三位有A或U，從而用G或C替換開放閱讀框第三位的A或U。并將此優(yōu)化策略用于其SARS-CoV-2疫苗CVnCoV，目前正處于III期試驗(yàn)階段。

為了翻譯，mRNA序列通常包含修飾的核苷，例如假尿苷、N1-甲基假尿苷或其他核苷類似物。修飾核苷的使用，特別是修飾尿苷，阻止了模式識(shí)別受體的識(shí)別，保證了翻譯過(guò)程產(chǎn)生足夠水平的蛋白質(zhì)。Moderna和Pfizer–BioNTech SARS-CoV-2疫苗都含有核苷修飾。另一種避免模式識(shí)別受體檢測(cè)的策略，使用序列工程化和密碼子優(yōu)化，通過(guò)提高疫苗mRNA的GC含量來(lái)消耗尿苷。

除了mRNA序列的改進(jìn)外，在簡(jiǎn)化mRNA生產(chǎn)方面也取得了重大進(jìn)展。臨床上使用的合成mRNA通過(guò)使用噬菌體RNA聚合酶T7（也可以使用T3和SP6聚合酶）從DNA質(zhì)粒在體外轉(zhuǎn)錄。另外，使用CleanCap的共轉(zhuǎn)錄封蓋技術(shù)，簡(jiǎn)化了純化步驟。

由于mRNA較大（10⁴–10⁶Da）且?guī)ж?fù)電，因此無(wú)法通過(guò)細(xì)胞膜的陰離子脂質(zhì)雙層。此外，在體內(nèi)，它會(huì)被先天免疫系統(tǒng)的細(xì)胞吞噬，并被核酸酶降解。因此，體內(nèi)應(yīng)用需要使用mRNA遞送載體，該載體轉(zhuǎn)染免疫細(xì)胞而不會(huì)引起毒性或不必要的免疫原性。目前，已經(jīng)為此開發(fā)了許多基于創(chuàng)新材料的解決方案。

脂質(zhì)納米顆粒（LNP）

脂質(zhì)納米顆粒是臨床上先進(jìn)的mRNA載體。截至2021年6月，所有正在研制或批準(zhǔn)臨床使用的SARS-CoV-2 mRNA疫苗均采用LNPs。LNP為mRNA遞送提供了許多好處，包括制劑簡(jiǎn)單、模塊化、生物相容性和較大的mRNA有效載荷容量。除RNA藥物外，LNP通常包括四種成分，可電離脂質(zhì)、膽固醇、輔助磷脂和聚乙二醇化脂質(zhì)，它們共同封裝和保護(hù)脆弱的mRNA。

可電離脂質(zhì)與mRNA在酸性緩沖液中形成納米顆粒，使脂質(zhì)帶正電荷并吸引RNA。此外，它們?cè)趦?nèi)涵體的酸性環(huán)境中帶正電荷，這促進(jìn)了它們與內(nèi)涵體膜的融合，將其釋放到細(xì)胞質(zhì)中。

DODAP和DODMA是第一種用于RNA輸送的可電離脂質(zhì)。通過(guò)設(shè)計(jì)提高DODMA的功效，產(chǎn)生了DLin-MC3-DMA。這是第一個(gè)FDA批準(zhǔn)的藥物制劑中使用的可電離脂質(zhì)：siRNA藥物patisiran（Onpattro）。除了有效且安全地遞送siRNA外，DLin-MC3-DMA還用于mRNA的遞送。

目前，學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的許多團(tuán)體使用組合反應(yīng)方案來(lái)合成潛在的傳遞材料，這種方法產(chǎn)生了許多有效的脂質(zhì)，包括C12-200、503O13、306Oi10、OF-02、TT3、5A2-SC8、SM-102（用于抗SARS-CoV-2的Moderna疫苗mRNA-1273）和ALC-0315（用于輝瑞疫苗BNT162b2）。

除了尋求提高療效外，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注提高藥物的特異性，特別是對(duì)疫苗和免疫療法的特異性。含有多環(huán)金剛烷尾的脂質(zhì)11-A-M58，和含有環(huán)咪唑頭的脂質(zhì)93-O17S59，已被設(shè)計(jì)用于體內(nèi)靶向T細(xì)胞。盡管機(jī)制尚不清楚，但這些脂質(zhì)的環(huán)狀基團(tuán)對(duì)于靶向T細(xì)胞至關(guān)重要。

盡管電離脂質(zhì)可以說(shuō)是LNP最重要的成分，但其他三種脂質(zhì)成分（膽固醇、輔助脂質(zhì)和聚乙二醇化脂質(zhì)）也促進(jìn)了納米粒子的形成和功能。膽固醇是一種天然存在的脂質(zhì)，它通過(guò)填充脂質(zhì)之間的空隙來(lái)增強(qiáng)納米顆粒的穩(wěn)定性，并有助于在攝取到細(xì)胞的過(guò)程中與內(nèi)涵體膜融合。

輔助脂質(zhì)通過(guò)促進(jìn)有助于膜與內(nèi)涵體融合的脂質(zhì)相變來(lái)調(diào)節(jié)納米顆粒的流動(dòng)性并增強(qiáng)功效。最佳輔助脂質(zhì)的選擇取決于可電離脂質(zhì)材料和RNA載體。例如，對(duì)于類脂質(zhì)材料，飽和輔助脂質(zhì)（如DSPC）適合傳遞短RNA（如siRNA），而不飽和脂質(zhì)（如DOPE）適合傳遞mRNA 。DSPC已被用于FDA批準(zhǔn)的SARS-CoV-2疫苗mRNA-1273和BNT162b2中。

LNPs的聚乙二醇化脂質(zhì)成分由聚乙二醇（PEG）與錨定脂質(zhì)（如DMPE或DMG）結(jié)合而成。親水性PEG可以穩(wěn)定LNP，通過(guò)限制脂質(zhì)融合調(diào)節(jié)納米顆粒大小，并通過(guò)減少與巨噬細(xì)胞的非特異性相互作用增加納米顆粒半衰期。mRNA-1273和BNT162b2 SARS-CoV-2疫苗均含有聚乙二醇化脂質(zhì)。

聚合物和聚合物納米顆粒

盡管臨床進(jìn)展不如LNP，但聚合物具有與脂質(zhì)相似的優(yōu)勢(shì)，能夠有效傳遞mRNA。陽(yáng)離子聚合物將核酸濃縮成具有不同形狀和大小的復(fù)合物，可通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。

聚乙烯亞胺是研究廣泛的核酸傳遞聚合物。盡管其功效，但由于其高電荷密度，其毒性限制了應(yīng)用。此外，已經(jīng)開發(fā)出幾種毒性較小的可生物降解聚合物。例如，聚（β-氨基酯）在mRNA傳遞方面表現(xiàn)出色，尤其是對(duì)肺。

最近開發(fā)出了一種新型的含脂聚合物，稱為電荷改變可釋放轉(zhuǎn)運(yùn)體（CARTs），它能有效地靶向T細(xì)胞，操縱T細(xì)胞是非常困難的，因此，CART 是一種有吸引力的傳遞材料，在mRNA疫苗和基因治療領(lǐng)域具有巨大潛力。

其他遞送系統(tǒng)

除了脂質(zhì)和聚合物載體外，肽也可以將mRNA傳遞到細(xì)胞中，這要?dú)w功于其主鏈和側(cè)鏈中的陽(yáng)離子或兩親胺基（例如精氨酸），這些陽(yáng)離子或兩親胺基與mRNA靜電結(jié)合并形成納米復(fù)合物。例如，含有重復(fù)的精氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸（RALA）基序的膜融合細(xì)胞穿透肽。

富含精氨酸的魚精蛋白肽在中性pH下帶正電荷，也可以濃縮mRNA并促進(jìn)其傳遞。魚精蛋白與mRNA復(fù)合物激活識(shí)別單鏈mRNA的Toll樣受體（TLR7，TLR8）通路，因此，它還可以作為疫苗或免疫治療應(yīng)用的佐劑。CureVac AG正在評(píng)估一種含有魚精蛋白的遞送平臺(tái)RNActive，用于黑色素瘤、前列腺癌和非小細(xì)胞肺癌的臨床試驗(yàn)。

最后，基于角鯊烯陽(yáng)離子納米乳液也可以傳遞mRNA，這些納米乳劑由油性角鯊烯核組成。一些角鯊烯制劑，如諾華的MF59，在FDA批準(zhǔn)的流感疫苗中用作佐劑。MF59使注射部位的細(xì)胞分泌趨化因子，從而招募抗原呈遞細(xì)胞，誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為樹突狀細(xì)胞，并增強(qiáng)抗原呈遞細(xì)胞對(duì)抗原的攝取。角鯊烯基陽(yáng)離子納米乳劑從內(nèi)涵體逃逸并將mRNA輸送到細(xì)胞質(zhì)中的機(jī)制尚不清楚。

在注射mRNA癌癥疫苗后，mRNA編碼的蛋白質(zhì)由核糖體合成，然后翻譯后修飾以產(chǎn)生正確折疊的功能蛋白質(zhì)，并呈現(xiàn)給免疫系統(tǒng)。該過(guò)程類似于RNA病毒感染和連續(xù)誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)的自然過(guò)程。外源mRNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)導(dǎo)致與內(nèi)源性mRNA類似的反應(yīng)。

誘導(dǎo)先天免疫反應(yīng)

宿主免疫系統(tǒng)通過(guò)PRRs檢測(cè)病原體相關(guān)分子模式（PAMP）激活固有免疫反應(yīng)。注射疫苗后，mRNA和傳遞系統(tǒng)成分將通過(guò)一系列PRR識(shí)別為外源性物質(zhì)，導(dǎo)致Toll樣受體（TLR）的激活，例如主要在抗原呈遞細(xì)胞（APC）上表達(dá)的TLR3、TLR7和TLR8。外源性IVT mRNA可被細(xì)胞膜、內(nèi)體以及細(xì)胞質(zhì)中的各種PRR識(shí)別，并在刺激內(nèi)源性免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用。

IVT mRNA的免疫原性主要由TLR7和TLR8介導(dǎo)。TLR7由B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞表達(dá)，并介導(dǎo)識(shí)別單鏈RNA（ssRNA）的過(guò)程。在細(xì)胞質(zhì)中，其他一些PRR可以感應(yīng)不同類型的RNA，例如dsRNA和ssRNA。

在非免疫細(xì)胞中，細(xì)胞質(zhì)維甲酸誘導(dǎo)基因I樣受體（RLR）和黑色素瘤分化相關(guān)基因5（MDA5）感應(yīng)外源mRNA并調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致天然免疫細(xì)胞募集到mRNA注射部位。

誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫反應(yīng)

mRNA疫苗接種后，編碼的蛋白質(zhì)將被翻譯并呈遞給免疫系統(tǒng)，并刺激適應(yīng)性免疫。mRNA編碼的蛋白質(zhì)通過(guò)內(nèi)吞或吞噬作用被APC吸收，它們可能形成吞噬小泡或含有抗原蛋白的內(nèi)體，抗原蛋白通過(guò)樹突狀細(xì)胞上的主要組織相容性復(fù)合體呈遞。

mRNA癌癥疫苗通常編碼在癌細(xì)胞上表達(dá)的TAA。這些TAA可進(jìn)一步分為組織分化抗原（如MART-1）、腫瘤生殖系抗原（如NY-ESO-1或MAGE-3）、腫瘤細(xì)胞過(guò)表達(dá)的正常蛋白（如EGFR、MUC1、Her2/neu）、病毒蛋白（如EBV、HPV）和腫瘤特異性突變抗原（如MUM-1、β-catenin或CDK4）。此外，體細(xì)胞突變可能產(chǎn)生新抗原表位，碼新抗原的mRNA疫苗被認(rèn)為是最佳的候選癌癥疫苗。

除了誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫外，mRNA疫苗還誘導(dǎo)中和抗體。濾泡輔助性T細(xì)胞（Tfh）不僅對(duì)生發(fā)中心的發(fā)育至關(guān)重要，而且還驅(qū)動(dòng)免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)化、親和力成熟和持久的B細(xì)胞記憶反應(yīng)。這些細(xì)胞可以被mRNA疫苗激活，產(chǎn)生足夠數(shù)量有效和持久的中和抗體。

基于IVT mRNA的疫苗正在逐步開發(fā)，用于多種腫瘤治療。目前，mRNA癌癥疫苗根據(jù)最終產(chǎn)品類型可以分為編碼TAA、TSA、細(xì)胞因子和抗體的癌癥疫苗。

編碼TAAs 的mRNA疫苗

在多項(xiàng)臨床試驗(yàn)中，NY-ESO-1、酪氨酸酶、MAGE-A3、MAGE-C2和TPTE已被用作黑色素瘤mRNA疫苗的TAA。

BNT111是一種BioNTech FixVac平臺(tái)開發(fā)癌癥疫苗，該平臺(tái)利用TAA的固定組合，旨在觸發(fā)針對(duì)癌癥的強(qiáng)大而精確的免疫反應(yīng)。2021年底，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了BNT111快速通道資格，這是一種治療晚期黑色素瘤的新型癌癥免疫療法，目前BNT111正在兩項(xiàng)臨床試驗(yàn)中進(jìn)行研究。一項(xiàng)I期試驗(yàn)（NCT02410733）的中期分析報(bào)告表明，BNT111是有效的免疫療法。隨后的II期試驗(yàn)（NCT04526899）研究BNT111單獨(dú)或與抗PD-1抗體cemiplimab聯(lián)合的安全性和有效性。

CV9201和CV9202是兩種針對(duì)非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)的靶抗原的mRNA疫苗。臨床試驗(yàn)（NCT00923312、NCT01915524、NCT03164772）表明，這兩種疫苗耐受性良好，治療后可以檢測(cè)到免疫反應(yīng)，從而支持在非小細(xì)胞肺癌中的進(jìn)一步臨床研究。

編碼TSA的mRNA疫苗

編碼多種突變抗原的mRNA疫苗是治療突變誘發(fā)的惡性腫瘤的理想疫苗，這種類型的癌癥疫苗進(jìn)行的臨床試驗(yàn)最多。隨著下一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，可以生產(chǎn)編碼突變抗原的個(gè)性化mRNA癌癥疫苗，這種個(gè)性化的癌癥疫苗具有非常誘人的前景。

兩種個(gè)性化mRNA癌癥疫苗目前正在進(jìn)行二期臨床試驗(yàn)，即Moderna的mRNA-4157和BioNTech的BNT122（RO7198457）。mRNA-4157在單個(gè)mRNA分子上特異性篩選和編碼20-34個(gè)新抗原，這取決于患者的癌癥突變。一期試驗(yàn)（NCT03313778）的中期數(shù)據(jù)表明，mRNA-4157單藥治療或與PD-1抑制劑Keytruda聯(lián)合治療在所有測(cè)試劑量下都具有良好的耐受性，并引發(fā)新抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)。該疫苗目前正在黑色素瘤患者進(jìn)行二期臨床試驗(yàn)（NCT03897881）。BioNTech 的BNT122已經(jīng)探索了與PD-L1抗體聯(lián)合治療的有效性和安全性，在黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌和大腸癌的II期臨床試驗(yàn)已于2021上半年啟動(dòng)。

mRNA編碼免疫刺激劑

理論上，mRNA癌癥疫苗可以編碼任何蛋白質(zhì)，包括免疫刺激劑，其可以重塑腫瘤免疫微環(huán)境（TIME），克服腫瘤免疫耐受，這已成為mRNA腫瘤疫苗研究的一個(gè)重要方向。

在過(guò)去幾年中，已經(jīng)進(jìn)行了編碼細(xì)胞因子的mRNAs癌癥疫苗的臨床試驗(yàn)。目前，臨床試驗(yàn)中只有七種候選產(chǎn)品，它們屬于Moderna和BioNTech。2017年，Moderna開發(fā)了第一個(gè)表達(dá)mRNA編碼的免疫刺激劑（mRNA-2416），其編碼OX40L，一項(xiàng)1期臨床試驗(yàn)（NCT03323398）評(píng)估了mRNA-2416單獨(dú)和與durvalumab聯(lián)合的安全性和耐受性。已有的數(shù)據(jù)表明，mRNA-2416單藥在所有劑量水平下都是可耐受的，沒有報(bào)告劑量限性，大多數(shù)相關(guān)不良事件為1級(jí)或2級(jí)。更重要的是，在PD-L1上調(diào)的時(shí)間內(nèi)觀察到廣泛的促炎活性和有益的變化。目前，mRNA-2416瘤內(nèi)注射已進(jìn)入晚期卵巢癌的臨床II期試驗(yàn)。

另一種mRNA疫苗mRNA-2752編碼OX40L/IL23/IL36γ，早期的臨床結(jié)果表明，mRNA-2752與抗PD-L1抗體durvalumab聯(lián)合使用，在所有劑量下都具有良好的耐受性，并顯示出抗腫瘤活性的跡象。

此外，BioNTech還開發(fā)了編碼IL-12sc、IL-15sushi、GM-CSF和IFNα的BNT131，其作為單一療法或與cemiplimab聯(lián)合用于晚期實(shí)體瘤患者。

幾十年來(lái)，mRNA設(shè)計(jì)和核酸遞送技術(shù)的進(jìn)步，加上新抗原靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，使得mRNA疫苗成為對(duì)抗癌癥的有力工具。mRNA疫苗的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在mRNA癌癥疫苗具有同時(shí)編碼多種抗原的能力，以及非整合、高度降解和無(wú)插入突變潛力。IVT產(chǎn)生的mRNA不含細(xì)胞和致病性病毒成分，沒有感染的可能性；在正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)中測(cè)試的大多數(shù)mRNA疫苗通常耐受性良好，注射部位特異性免疫反應(yīng)很少。

快速生產(chǎn)是mRNA癌癥疫苗的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)，并且mRNA制造技術(shù)的成熟允許在短時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)新型疫苗。最近新抗原的發(fā)現(xiàn)和鑒定促進(jìn)了個(gè)性化疫苗治療的發(fā)展。BioNTech和Moderna進(jìn)行的幾項(xiàng)臨床研究表明，在一些治療多發(fā)性實(shí)體瘤的臨床試驗(yàn)中，使用個(gè)性化疫苗具有強(qiáng)大的抗腫瘤免疫，開創(chuàng)了治療性腫瘤疫苗的新時(shí)代。我們有理由認(rèn)為，mRNA療法將可能改變現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的疫苗接種方法以及癌癥免疫療法。